Dijagnoza botulizma temelji se na identifikaciji toksina Clostridium botulinum u laboratoriju i na promatranju kliničkih simptoma, iako su ponekad nespecifični. Bolest se zapravo može pomiješati s Guillain-Barréovim sindromom, poliomijelitisom, moždanim udarom, mijastenijom gravis i paralizom krpelja.
U botulizmu hrane, slika neuromuskularnih poremećaja i gutanja potencijalno onečišćene hrane važni su znakovi. Istovremena manifestacija kod najmanje 2 pacijenta koji jedu istu hranu pojednostavljuje dijagnozu. Potvrda se dobiva izoliranjem mikroorganizma testom kulture sumnjivih uzoraka hrane ili izmetom pacijenta i identifikacijom botulinum toksina u hrani ili biološkim materijalima (kao što su krv, želučani sok i povraćanje).
S druge strane, u botulizmu rane to potvrđuje dijagnoza serumskog toksina ili izolacija Clostridium botulinum iz uzorka kožne lezije.
